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| 问题 | 可能原因 | 验证或解决办法 |
| 背景高 | 膜没有完全均匀湿透 | 使用100% 甲醇浸透膜5-10min |
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洗膜不充分 |
增加洗液体积和洗涤次数 | |
| 阻断不充分 | 增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等） | |
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二抗浓度过高 |
降低二抗浓度 | |
| 检测过程中膜干燥 | 保证充分的反应液，避免出现干膜现象 | |
| 曝光过度 | 缩短曝光时间 | |
| 抗体与阻断蛋白有交叉反应 | 检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应 | |
| 没有阳性条带，或者阳性条带比较弱 | 抗体染色不充分 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 |
| 酶失活 | 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 | |
| 标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。 | |
| 可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。 | ||
| 试剂不匹配 | 一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性 | |
| 一抗失效 | 选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液 | |
| HRP抑制剂 | 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 | |
| 膜没有完全均匀湿透 | 使用100%甲醇浸透膜 | |
| 靶蛋白分子量小于10Kd | 选择小孔径的膜，缩短转移时间 | |
| 甲醇浓度过高 | 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬， | |
| 从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 | ||
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转移时间不够 |
对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间 | |
| 抗体染色不充分 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 | |
| 标本中靶蛋白含量太低 | 增加标本上样量。 | |
| HRP抑制剂 | 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 | |
| 抗体活性降低 | 选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置 | |
| 封闭过度 | 减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型 | |
| 曝光时间过短 | 延长曝光时间 | |
| 二抗的非特异性结合 | 增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗 | |
| （特异性更强的，只针对重链的） | ||
| 一抗的特异性不够 | 使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性 | |
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蛋白降解 |
使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 | |
| 二聚体或多聚体存在 | 增加蛋白质变性过程及强度 | |
| 抗体浓度过高 | 降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带 | |
| 蛋白上样量过大 | 降低上样量 | |
| 封闭剂中有聚集体 | 使用前过滤封闭试剂 | |
| 条带位置不对；或有非特异性条带 | HRP耦联二抗中有聚集体 | 过滤二抗试剂，去除聚集体 |
| HRP含量过高 | 降低酶联二抗的浓度 |
